牛乳中蛋白质的提取与鉴定

   日期:2013-09-23     来源:实验室资讯网    浏览:35600    
  一、目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理
牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质,其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳罩中约占总蛋白量3/4,牛乳中约占总蛋白量的5/6。酪蛋白是一种含磷蛋白的不均一混合物。
蛋白质在其等电点pH 溶液中溶解度降底。根据这个原理,将牛乳的PH调整至4.8,即酪蛋白的等电点时,酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪,得到纯的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。
除去酪蛋白的滤液中,尚含有球蛋白,清蛋白等多种蛋白质。
试剂
1、醋酸钠缓冲液(0.2M pH4.6)。
2、米伦(Millon)试剂:将汞100g 溶于140ml(比重1.42)的浓硝酸中(在通风橱内进行)。然后加两倍量的蒸馏水稀释。
3、95%乙醇
.
5、10%NaGl.
6、0.5%NaGO
7、0.1NaON
8、0.2%HC1.
9、饱和氢氧化钙[Ca(OH)]
10、5%醋酸铅
三、操作
(一)酪蛋白的制备取新鲜牛乳100ml,放入250 ml 烧杯中加热至40℃.加入100ml 加热至同样温度的醋酸缓冲液,一边加一边摇动,并用pH为4.7(用1%NaOH 或10%醋酸进行调整)。冷却至室温,继续放置5 分钟,然后用细纱布或滤纸过滤。滤液为乳清保留以下做鉴定。过滤所得沉淀物,用少量蒸馏水洗几次,过滤。将洗净的沉淀物悬浮在约30ml 乙醇中,
用布氏漏斗抽滤。所得沉淀用乙醇和等量混合液洗涤两次,抽干。最后用50ml 洗一次并抽干。取出抽干的粉状物,摊开在表面皿上, 使完全挥发。称其干重计算其产量。
(二)酪蛋白的性质鉴定
1.溶解度:取试管6 支,分别加水、10%氯化钠、0.5%氯化钠,0.1N 氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙溶液各2ml。于每管中加入少量酪蛋白。不断摇荡,观察并记录各管中的酪蛋白溶解度。
2、米伦反应1:取酪蛋白少许,放置于试管中。加入1ml 蒸馏水,再加入米论试剂10 滴,振摇,并徐徐加热。观察其颜色变化。
3、含硫(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:取少量酪蛋白溶于1ml0.1N NaOH 溶液中,再加入1-3 滴5%醋酸铅,加热煮沸,溶液变为黑色。
(三)乳清中可凝固性蛋白质的鉴定将制备酪蛋白时所得的滤液移入烧杯中,徐徐加热。即出现蛋白质沉淀。此为乳清中的球蛋白和清蛋白。注附:米伦反应是由于蛋白质分子中有羟基苯基(-CH-OH)存在之故.一些在3.5 位置上没有取代基的酚类化合物,例如酪氨酸、酚及廱香酚也呈阳性反应。在蛋白质分子中,只有酪氨酸才具有羟基苯基,所以蛋白质对米伦试剂起阳性反应。
 
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